Fragen und Probleme » puma basket platform patent

ÿþVor dem Hintergrund einer puma basket platform patent früheren Studie [25], in der gezeigt wurde, dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und puma basket platform white der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen puma basket rosa abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Vektor- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektantenzellen wurden 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin ausgesetzt und dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Die Erzeugung und Charakterisierung der isogenen Zelllinien wurde bereits beschrieben [9]. (D) Western Blot zeigt an, dass U87MG-Vektorzellen ein sehr geringes Maß an endogenem EGFR (höheres Molekulargewicht; 175 kD) exprimieren, während U87MG-EGFRvIII-Zellen eine signifikante EGFRvIII-Expression (140 kD) enthalten -Expression von EGFRvIII in U87MG-Zellen führte zu einer signifikanten Resistenz gegen Anisomycin-induzierte Apoptose (3c, d).

Diese Beobachtungen wurden in puma basket sale stabilen Transfektanten von U87MG-EGFRvIII (oberes Feld) und U87MG-EGFR (mittleres Feld) sowie in T98G-GBM-Zellen gefunden, die hohe Mengen an endogenem EGFR (unteres Feld) exprimieren. Als Negativkontrollen verwendetes Maus-IgG ergab kein Signal, was auf die Spezifität des Assays hinweist. Es ist bemerkenswert, dass die endogenen EGFR-Spiegel durch Staurosporin in T98G-Zellen leicht verringert wurden (rechtes Feld). Dies wird möglicherweise auf die Caspase-vermittelte Spaltung nach Staurosporin-Behandlung zurückgeführt [39]. Sowohl EGFR als auch EGFRvIII existieren im Komplex mit PUMA konstitutiv und die Wechselwirkungen werden unter apoptotischem Stress aufrechterhalten.

Das Fehlen von ±-Tubulin und Cox IV in den mitochondrialen bzw. nicht mitochondrialen Fraktionen zeigte die Wirksamkeit der Fraktionierung an. Niedrige mtPUMA-Indizes deuten darauf hin, dass PUMA hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter ungestressten und gestressten Bedingungen lokalisiert ist. (B) PUMA ist ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen von U87MG-Vektorzellen lokalisiert. U87MG-Vektorzellen wurden behandelt, fraktioniert und Proteine   analysiert, wie zuvor in Panel a beschrieben. Die mtPUMA-Indizes in diesen Zellen sind 1,0, was darauf hinweist, dass PUMA unabhängig von apoptotischem Stress ausschließlich in den Mitochondrien dieser Zellen nachgewiesen wird. (C) Der Abbau der EGFR-Expression durch siRNA führt puma basket satin zu einer erhöhten mitochondrialen Translokalisierung von PUMA.

PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.